Analisi strutturale e principi architettonici dei riccioli amiloidi batterici

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Analisi strutturale e principi architettonici dei riccioli amiloidi batterici

Nature Communications volume

Nature Communications volume 14, numero articolo: 2822 (2023) Citare questo articolo

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Sono trascorsi due decenni dall’affermazione iniziale secondo cui gli amiloidi non sono solo sottoprodotti (tossici) di una cascata di aggregazione involontaria, ma possono anche essere prodotti da un organismo per svolgere una funzione biologica definita. Quell'idea rivoluzionaria è nata dalla consapevolezza che un'ampia frazione della matrice extracellulare che trattiene le cellule Gram-negative in un biofilm persistente è composta da fibre proteiche (curli; tafi) con architettura cross-β, cinetica di polimerizzazione dipendente dalla nucleazione e classica struttura proprietà tintoriali dell'amiloide. L'elenco delle proteine che formano le cosiddette fibre amiloidi funzionali in vivo si è notevolmente ampliato nel corso degli anni, ma non sono seguite informazioni strutturali dettagliate con un ritmo simile, in parte a causa delle barriere sperimentali associate. Qui combiniamo un'ampia modellazione AlphaFold2 e la microscopia a trasmissione crioelettronica per proporre un modello atomico delle protofibrille di curli e le loro modalità di organizzazione più elevate. Scopriamo un'inaspettata diversità strutturale di elementi costitutivi di curli e architetture di fibrille. I nostri risultati consentono una razionalizzazione dell’estrema robustezza fisico-chimica dei curli, nonché le precedenti osservazioni sulla promiscuità dei curli tra specie, e dovrebbero facilitare ulteriori sforzi ingegneristici per espandere il repertorio di materiali funzionali basati su curli.

Sebbene una volta considerato un obiettivo non plausibile per la biologia strutturale, i recenti sviluppi nella microscopia crioelettronica (cryoEM) e nell'elaborazione elicoidale hanno facilitato la determinazione della struttura delle fibrille amiloidi con una risoluzione quasi atomica1. Una pletora di strutture determinate sperimentalmente sia di amiloidi generati in vitro che isolati ex vivo ha rivelato una sconcertante diversità strutturale delle architetture delle fibre, compreso il concetto di polimorfi delle fibre o ceppi di sequenze altrimenti identiche o strettamente correlate2,3,4,5. Nonostante le differenze nell’architettura delle proto-fibrille e nella simmetria elicoidale delle fibre, la maggior parte delle strutture amiloidi condividono diverse caratteristiche conservate che ci consentono di espandere la definizione della piega amiloide oltre il tradizionale adagio cross-beta. Per quanto ne sappiamo, tutte le strutture amiloidi attualmente descritte consistono in un impilamento ripetitivo di arrangiamenti intricati, serpentini e planari di filamenti β che sono stabilizzati da motivi a cerniera sterica in cui le catene laterali residue interdigitate formano estesi Van der Waals, elettrostatici, idrofobici e idrogeno contatti di collegamento. L'impilamento assiale di peptidi planari mediante l'aggancio del filamento e la formazione dell'arcata β guida la formazione di protofibrille, solitamente seguita dall'avvolgimento elicoidale di più protofibrille in una sovrastruttura elicoidale straordinariamente stabile. È proprio questa simmetria elicoidale che è stata sfruttata con grande successo nei moderni approcci cryoEM per risolvere i dettagli strutturali di un’ampia gamma di strutture amiloidi.

La maggior parte di queste strutture appartengono a una sottofamiglia di specie amiloidi correlate a una serie di malattie (neuro)degenerative, da deposizione sistemica e da misfolding. Per questo motivo, queste proteine amiloidogeniche vengono comunemente chiamate amiloidi patologici (PA). Questi amiloidi associati alla malattia hanno in comune il fatto di rappresentare un evento di misfolding e aggregazione non funzionale e fuori percorso di proteine o frammenti proteici a cui è stato impedito di raggiungere la loro struttura nativa a causa di mutazioni, condizioni ambientali o elaborazione errata. Esiste un secondo ramo della famiglia amiloide, presente in tutti i domini della vita, che consiste di proteine che si sono evolute per svolgere ruoli biologici dedicati (come adesione, stoccaggio, impalcatura, ecc.) adottando lo stato amiloide, offrendo a queste proteine la termine amiloidi funzionali (FA)6,7,8. Come gli amiloidi patologici, gli FA mostrano un'aggregazione dipendente dalla nucleazione in fibre con caratteristiche cross-β. Una questione enigmatica è se i percorsi dell’AF includano tratti selezionati per mitigare o mancare il guadagno citotossico delle proprietà funzionali così comunemente associate alle deposizioni patologiche di amiloide. Per le vie dell'amiloide batterica come Curli e Fap, è chiaro che le proteine accessorie assicurano una deposizione di amiloide tempestiva e localizzata, comprese protezioni simili a chaperone che prevengono o arrestano l'amiloidogenesi prematura9,10. Tuttavia, è molto meno chiaro se le strutture delle subunità e delle fibre FA includano anche tratti adattativi che riducono la citotossicità. È interessante notare che ci sono indicazioni da esperimenti in vitro che gli AF prodotti da vari batteri patogeni possono mostrare reattività crociata con PAs11 e segnalazioni di un'induzione o aggravamento potenzialmente infettivo di deposizioni patologiche di amiloide mediante disseminazione incrociata diretta o effetti (infiammatori) indiretti nell'uomo e animali esposti ad amiloidi batterici12,13. Poiché ci sono solo poche strutture disponibili per gli FA14,15, non è chiaro a questo punto se gli FA siano strutturalmente correlati ai PA e se formino un ramo separato delle architetture amiloidi. Né è chiaro quale potrebbe essere il meccanismo molecolare alla base di questa promiscuità di amiloide FA/PA tra le specie.

90 as high accuracy predictions, between 70 and 90 as good backbone predictions, and pLDDT <70 as low confidence and to be treated with caution31. All models share a similar β-solenoid architecture, wherein curlin repeats fold into strand-β-arc-strand motifs that stack vertically to produce an in-register double, parallel β-sheet structure with a single strand stagger (i.e., 2.4 Å) between both sheets (Fig. 2, Supplementary Fig. 2). This topology fits with our cryoEM observations on mature curlin fibrils, which we discuss in detail below. It also means that variations in the number of repeats correlate linearly to the long-axis dimension of a CsgA monomer, and that the curliome spans a continuum of solenoidal monomers./p>10 independent sample preparations./p>5 independent sample preparations./p>6 and higher; Table S2, Supplementary Fig. 15)45. Known structures including β-solenoid domains include, amongst others, antifreeze and ice binding proteins, phage tail spikes, adhesins, Leu-rich repeat proteins, glycosidases, S-layer proteins (Table S2; Supplementary Fig. 15,a). Our search did not identify any polymerizing or amyloid-like proteins. Instead, the β-solenoid domains form a structural scaffold for the protein monomers, rather than a polymerization unit. In these β-solenoid proteins, structural imperfections in the terminal solenoid motif(s) or additions of sterically blocking domains prevents polymerization by head-to-tail or tail-tail/head–head interactions of the monomers. Notably, a structural similarity against the human Alphafold protein structure database identifies several proteins showing open-edged β-solenoid domains (Supplementary Table 2; Supplementary Fig. 15b), including extracellular matrix proteins such as mucins and keratin associated proteins, or suprabasin and uncharacterized protein FLJ40521. It is unclear, however, whether these β-solenoid domains support polymerization in these proteins. In curli, the structural preservation and complementarity throughout the β-solenoid is guaranteed by a high degree of conservation of a limited number of key residues that partake in steric zipper contacts and the stabilization of β-arcade structures. In that respect, we note that Zhou and coworkers have shown that promiscuous cross-seeding can occur between curli produced in interspecies biofilms—a process that is likely dependent on a conserved curli architecture36. Also, extracellular matrix components such as curli have been proposed as a secreted public good, at least in single species biofilms46. The structural conservation in curli subunits may enable mixed fiber formation and thus allow multispecies contribution of curli monomers to the biofilm matrix. It is interesting to speculate that the solenoid polymorphisms found in the conformational curlin families defined in this work, i.e., CS, NCS and D, may result in some specificity of curlin cross-seeding and possibly in multispecies biofilm associations. In recent years, increasing attention has also gone to the potential cross-seeding activity of curli released by commensal and pathogenic Proteobacteria towards human pathological amyloids, with multiple reports indicating an in vitro and in vivo seeding or stimulatory activity towards α-synuclein amyloidogenity12,47,48. In this respect, it is interesting to note that our structural similarity of the human Alphafold protein structure database identifies several proteins with open-edged β-solenoid domains with high structural similarity to the curlin fold (Supplementary Table 2; Supplementary Fig. 15b), including extracellular and mucosal proteins like keratin associated proteins and mucins. This may warrant an increased attention to a potential interaction of mucosal matrix proteins and curli-producing commensals and pathogens in the intestinal and urinary tract./p>

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